Secukinumab

01 文章介绍 主要研究机构与主导团队：本研究由美国华盛顿大学蛋白质设计研究所和生物化学系David Baker团队主导，Stephanie Berger为第一作者及共同通讯作者。研究联合慕尼黑大学医院、约翰斯·霍普金斯大学、纽约大学朗格尼医学中心、斯坦福大学医学院及霍华德·休斯医学研究所等机构完成。 2024年8月，华盛顿大学David Baker团队在《Cell》发表研究，尝试解决抗体药物难以口服、组织渗透有限和生产成本较高的问题。作者从头设计靶向IL-23R和IL-17A的微型蛋白，通过计算设计、酵母展示筛选、深度突变扫描和稳定性优化，将候选物推进至生化、细胞、人体来源类器官、大鼠药代分布及人源化小鼠结肠炎验证。其中，7 kDa的IL-23R微型蛋白23R-91具有低于1 pM的结合亲和力，经口给药后可进入肠组织，并在结肠炎模型中改善疾病指标，为口服蛋白药提供了临床前概念验证。 02 研究背景与问题 IL-23和IL-17是Th17炎症通路中的关键因子，也是炎症性肠病和银屑病等自身炎症性疾病中经过临床验证的治疗靶点。针对这些靶点的单克隆抗体已经取得疗效，但并非所有患者都能获得或维持缓解；抗体还需要静脉输注或皮下注射，制造、纯化、运输和储存成本较高，较大的分子尺寸也会限制组织渗透。 小分子JAK抑制剂可以口服，但全身性安全风险限制了部分患者的使用。正在开发的口服抗体、纳米抗体或多肽通常需要特殊制剂、非天然氨基酸或化学交联，以抵抗胃酸和胃肠道蛋白酶。这些工程措施可能增加制造复杂度，也不一定同时解决亲和力、稳定性和组织暴露问题。 从头设计微型蛋白通常只有数十个氨基酸，理论上兼具较小尺寸、较高靶点亲和力、可编程结构以及微生物表达优势。不过，口服蛋白药仍需跨越三道障碍：首先要在胃肠环境中保持完整，其次要穿过肠上皮屏障，最后还要在靶组织达到足以持续抑制受体的浓度。作者因此选择IL-23R和IL-17A作为模型靶点，检验计算设计的微型蛋白能否完成从分子设计到口服动物疗效的完整验证链条。 03 核心方法与研究流程 作者首先利用人IL-23与IL-23R复合物结构以及人IL-17A与IL-17RA复合物结构确定设计界面。IL-23R方向保留了IL-23p19上的天然关键结合位点W156，并加入计算生成的新位点；IL-17A方向则使用模拟IL-17RA结合界面的从头生成位点。数千种已有实验稳定性基础的微型蛋白骨架被对接至目标表面，再使用Rosetta优化界面氨基酸及侧链构象。 经过计算指标过滤，作者分别为IL-23R和IL-17A合成约15,000个候选基因，并将其展示在酵母表面。研究通过多轮荧光激活细胞分选富集可结合靶点的候选物，再用二代测序比较设计序列在筛选前后的富集程度。首轮获得两个IL-23R设计23R-1、23R-2，以及三个IL-17A设计17-1、17-2和17-3，分子长度为43至61个氨基酸。 随后，作者为这些候选物建立全单点饱和突变文库，用深度突变扫描寻找可提高结合能力的突变；再将优势突变组合成新文库，进行多轮亲和力筛选。为提高胃肠稳定性，团队引入分子内二硫键，并直接在模拟胃液和模拟肠液处理后筛选仍能结合靶点的变体。最终得到IL-23R候选物23R-72和23R-91，以及IL-17A候选物17-51和二价连接体17-53。 候选物通过大肠杆菌表达和纯化，利用生物膜干涉或表面等离子共振检测结合亲和力，以细胞报告系统评价IL-23或IL-17信号抑制能力，并通过圆二色谱、模拟胃肠液消化、体积排阻色谱和质谱评价稳定性与单体状态。23R-91还完成了X射线晶体结构解析。 功能验证依次包括大鼠结肠、肠系膜淋巴结和脾细胞，人外周血CD4阳性T细胞，以及来自人皮肤上皮细胞的类器官。体内部分使用健康大鼠和TNBS处理大鼠评价口服后的胃肠组织分布与血液暴露，最终在人炎症性肠病患者外周血单个核细胞重建的NSG小鼠结肠炎模型中，将口服23R-91与腹腔注射抗IL-23抗体guselkumab进行比较。 04 主要发现 1. 计算设计与体外进化将候选物推进至皮摩尔级结合 最初设计的IL-23R和IL-17A微型蛋白已能以低纳摩尔亲和力结合靶点，并在报告细胞中以剂量依赖方式抑制相应信号。经过饱和突变扫描和组合文库筛选，IL-23R优化变体的结合亲和力比初始设计提高约100至1,000倍，细胞效力提高约30至300倍。最终候选物23R-72对IL-23R的结合亲和力为75 pM；23R-91由于解离速度过慢，其亲和力低于检测仪器的1 pM下限。 IL-17A方向采用另一种增效策略：作者用柔性连接肽将两个17-51连接为二价分子17-53，使其同时结合IL-17A同源二聚体的两个对称位点。17-53的细胞效力较单体17-51提高2,800倍，较初始计算设计17-2提高约60,000倍。在同一细胞报告体系中，17-53抑制人IL-17A信号的效力分别约为secukinumab和bimekizumab的200倍和4倍。不过，这属于体外实验结果，不能直接等同于体内疗效或临床剂量优势 2. 二硫键设计和胃肠液定向筛选显著提高候选物稳定性 初始IL-23R设计23R-1在模拟胃液和模拟肠液中的半衰期均不足5分钟。加入一个分子内二硫键后得到的23R-64，其模拟肠液和模拟胃液半衰期分别提高至约30分钟和4小时。在此基础上，作者先在模拟肠液中处理酵母展示文库，再筛选仍能结合IL-23R的变体，最终获得23R-72和23R-91。 23R-72在模拟肠液中的半衰期达到4至24小时，与处于临床开发阶段的口服抗TNF纳米抗体V565相当。23R-91的模拟肠液半衰期约60分钟，模拟胃液半衰期为4至24小时；两款候选物在95摄氏度和高浓度化学变性剂条件下仍基本保持螺旋结构。23R-91还可浓缩至超过100 mg/mL，浓缩后体外效力未发生明显变化。这些结果表明，作者不仅优化了结合力，还针对口服蛋白药最关键的胃肠稳定性进行了定向筛选 3. 晶体结构和人体来源模型支持设计机制 作者解析了23R-91与设计相关的1.9 Å晶体结构。晶体不对称单元中的两条蛋白链与计算模型的主链均方根偏差分别为0.7 Å和0.4 Å；核心结合区域、疏水核心及设计的二硫键构象与计算模型高度接近。体积排阻色谱和质谱进一步显示，23R-91主要以单体存在，并具有预期的7,206.8 Da分子量。这为计算设计得到的折叠方式提供了直接结构证据，但论文没有报告23R-91与IL-23R复合物的实验结构 功能层面，23R-91能够抑制大鼠结肠固有层、肠系膜淋巴结和脾细胞中的IL-23依赖性信号；IL-23R微型蛋白也能以低纳摩尔半数抑制浓度阻断原代人CD4阳性T细胞中的STAT3磷酸化。对于IL-17A方向，作者在人皮肤上皮细胞来源类器官中加入15 nM IL-17A，并同时或延迟1至3小时加入75 nM的17-51。经过约16小时培养，CCL20、CXCL8和S100A7等下游炎症标志物均受到显著抑制。这些实验将验证范围从工程报告细胞扩展至原代细胞和人体来源类器官，但17-51尚未接受动物疗效验证 4. 口服IL-23R微型蛋白能够进入肠组织，但系统暴露短暂且依赖剂量 健康大鼠接受单次20 mg/kg口服23R-72或23R-91后6小时，小肠内容物中的候选物浓度约为50至100 nM，小肠组织中约为40至200 nM，结肠组织中约为2至20 nM；这一剂量下，健康大鼠血清中未检测到候选物。胃肠保护性载体并未显著提高组织浓度，说明候选物自身已具有一定胃肠稳定性。 当23R-91口服剂量提高至140 mg/kg时，健康大鼠给药15分钟后的血清浓度达到73 nM，但血液消除半衰期只有约15分钟，3至24小时已接近或低于检测限。在TNBS处理大鼠中，23R-72经口灌胃、23R-91经盲肠导管给药，连续9天、每天3次给予20 mg/kg后，两者在胃肠组织中达到低纳摩尔浓度，但系统生物利用度仍然较低。结果证明候选物可以跨越部分胃肠屏障，却也显示其暴露持续时间和剂量效率仍需进一步优化5. 23R-91在人体免疫细胞重建的小鼠结肠炎模型中改善疾病指标 由于23R-91可高亲和结合人、猕猴和大鼠IL-23R，却几乎不结合小鼠IL-23R，作者选择由炎症性肠病患者外周血单个核细胞重建的NSG小鼠模型。小鼠在第7和14天接受直肠乙醇刺激诱导结肠炎；23R-91以8或80 mg/kg每日一次口服给药，guselkumab则以4 mg/kg在第6和13天腹腔注射。第18天评价总体健康、结肠肉眼炎症及组织学炎症和纤维化。 8和80 mg/kg口服23R-91均较未治疗模型组显著改善疾病评分，数值上的改善幅度高于guselkumab组。没有一种治疗显著降低结肠纤维化。需要强调的是，统计检验主要比较各治疗组与模型对照组，论文没有提供23R-91与guselkumab之间的直接优效或非劣效检验，因此这些结果支持“疗效相当或具有可比活性”的临床前概念，不能证明口服23R-91优于该抗体 05 研究价值、局限与总结 这项研究的主要价值，是将从头设计微型蛋白从“高亲和力结合剂”推进到“可口服给药的临床前候选形式”。23R-91的输入是肠腔中的口服微型蛋白，作用对象是表达IL-23R的人源免疫细胞；其输出是IL-23信号抑制以及结肠炎相关临床、肉眼和组织学评分改善。计算设计主要缩短了初始结合骨架和靶点界面的搜索过程，深度突变扫描与酵母展示则加快了亲和力及胃肠稳定性的迭代，但论文没有比较传统研发流程所需的时间、成本或实验轮次，因而不能量化其究竟缩短了多少研发周期。 从候选药物阶段判断，23R-91已经获得生化、原代细胞、动物药代分布和人源化小鼠疾病模型证据，属于临床前概念验证候选物，尚未进入人体临床试验。17-51和17-53主要停留在生化、细胞和人体来源类器官阶段，其中17-53虽然具有更强的体外效力，但没有动物疗效、药代或口服分布证据。因此，本研究不能被表述为已经开发出临床可用的口服IL-17药物。 研究的局限首先在于剂量。人源化小鼠疗效试验使用8或80 mg/kg口服剂量，大鼠药代实验最高达到140 mg/kg；作者估算8 mg/kg对应65 kg成人约520 mg活性成分，但这只是简单的质量换算，并非经过异速缩放、制剂优化或人体药代预测的临床剂量。其次，23R-91虽然可进入血液，但游离蛋白清除很快，能否在人体中维持持续IL-23R占有仍未验证。研究使用的主要是液体灌胃或盲肠导管给药，尚未建立可制造、可储存、可在特定肠段释放的片剂或胶囊。 动物模型也不能完整模拟人类炎症性肠病。NSG小鼠缺乏完整的T、B和自然杀伤细胞系统，疾病由患者外周血细胞重建并结合乙醇刺激诱导；该模型可验证对人IL-23R的作用，却不足以评价长期免疫调节、感染风险和复杂疾病异质性。23R-91的低免疫原性目前主要来自计算预测和既往同类分子的间接证据，本研究没有提供长期重复给药后的抗药抗体、安全药理或毒理学结果。 开放性方面，论文明确说明没有产生新的分析代码。主图和补充图源数据、深度突变扫描原始及处理数据、原始凝胶图和晶体结构数据均已公开：深度突变扫描数据存入GEO，编号GSE263250；23R-91晶体结构存入PDB，编号8UTK；图源数据存入Mendeley Data。质粒DNA序列可联系作者获取。本次附件包含正文、STAR Methods和补充图S1至S7，但未包含正文引用的补充表S1至S7，因此序列清单、完整药代数值、晶体学统计、疾病评分矩阵及免疫原性预测细节无法从附件中独立核实。 总体而言，研究最重要的贡献是建立了一条较完整的口服微型蛋白研发路线：结构界面设计产生初始结合剂，深度突变扫描提升亲和力，模拟胃肠液筛选和二硫键工程增加稳定性，再通过组织分布与疾病模型检验口服后的实际功能。23R-91证明了约7 kDa的天然氨基酸微型蛋白可以在不依赖复杂递送装置的情况下，经口给药后到达肠组织并产生药理效应。 下一步需要解决的重点不是继续追求更低的体外亲和常数，而是降低有效剂量、延长靶点占有、开发肠段特异释放制剂，并完成重复给药毒理、免疫原性和更接近临床疾病过程的动物验证。只有在这些问题解决并进入人体研究后，才能判断这种从头设计微型蛋白能否真正成为抗体药物之外的口服生物药平台。